G418 Sulfate (Geneticin) 遺傳霉素

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產品標簽

G418 Sulfate G418硫酸鹽；Geneticin遺傳霉素；Neomycin resistance gene (neo)；Blasticidin S 殺稻瘟菌素（滅瘟散）；Zeocin博萊霉su；CAS：108321-42-2

產品信息

產品描述

G418，又稱為G418硫酸鹽（G418 Sulfate），遺傳霉素（Geneticin），是一種氨基糖苷類抗生素，結構上類似于慶大霉suB1（Gentamicin B1），對細菌、酵母菌、原蟲和蠕蟲、以及高等植物和哺乳動物細胞都有毒性。由紅橙小單孢菌（Micromonospora rhodorangea）代謝產生，與核糖體結合，引起翻譯中無意義突變鏈的產生，最終抑制多肽合成和蛋白延伸。G418在分子遺傳學實驗中普遍用作一種篩選抗生素。對G418的抗性主要由新霉su抗性基因（neo）賦予，位于轉座子Tn601(903)（氨基糖苷磷酸轉移酶3’[I]或APH 3’[I]）和Tn5（氨基糖苷磷酸轉移酶3’[II]或APH 3’[II]）。這些基因源自細菌，但可在真核細胞中表達。將這些基因中的任何一個導入細胞均可以使細胞獲得G418抗性，從而能在含G418的培養基中生長。

哺乳動物細胞中，當抗性基因neo整合進入真核細胞基因組，使其能編碼氨基糖苷磷酸轉移酶3’[II]（APH 3’[II]），此酶通過共價修飾G418的氨基或羥基功能，抑制抗生素-核糖體間的相互作用，從而使得抗生素失活。這一特性賦予細胞產生G418抗性。

植物細胞中，當抗性基因nptII導入細胞內，其也能編碼氨基糖苷磷酸轉移酶，從而使得多種抗生素喪失活性，包括G418，卡那霉su和巴龍霉su。

我司（懋康生物）提供兩種形式的G418硫酸鹽，

一種以凍干粉形式提供（貨號：MS0010-1G，MS0010-5G），易溶于水（50mg/mL）。需過濾除菌后使用。

一種以溶于水的儲存液形式提供（貨號：MS0010-20ML），無菌溶液，可直接使用。

對于基因篩選實驗，需要建立殺滅曲線（劑量反應曲線）確定能夠殺死無抗性細胞的zui低有效濃度。

產品特性

1）   CAS NO.：108321-42-2

2）   同義名：G-418; G418; Antibiotic G418 sulfate; G 418 disulfate salt; Geneticin; Glycoside-418, Sulfate; BRN 1669188; G418硫酸鹽；G-418硫酸鹽；G418二硫酸鹽；遺傳霉素；

3）   分子式：C20H40N4O10· 2H2SO4

4）   分子量：692.7

5）   外觀：白色至類白色粉末

6）   純度：≥98%（HPLC）

7）   活性：≥700 μg/mg（基于干重）

8） 化學結構：

保存與運輸方法

保存：凍干粉-20℃干燥保存，至少3年有效，防止受潮，否則會引起抗生素活性降低。儲存液-20℃保存，至少2年有效。

運輸：室溫運輸。

使用方法

一、  G418儲存液的制備

1.1   對于G418凍干粉（貨號：MS0010-1G，MS0010-5G）

1）活力單位的換算

公式：（1000/A0）×A1=A2，其中A0是G418的活力值（Potency），因批次而異。可見批次對應的質檢報告，或者瓶子上的標簽。A1是想配制的G418活性濃度。A2是實際稱重的粉末與體積比濃度。

示例：若所用批次的G418 活力值為：720 µg/mg，要配制50mg/mL的G418活性濃度，則實際要配制的粉末濃度為1000/720×50 mg/ml=69.44 mg/mL。

如果配制10ml的G418儲存液（活性濃度，50 mg/ml），則需要稱取694.4mg粉末。

2）除菌和保存

根據上述換算得到的實際粉末稱重，加入10 ml去離子水內使其完quan溶解。

先用5ml去離子水預濕潤0.22μm針頭式過濾器，除盡水。之后使用此濾器過濾，除菌后分裝成單次使用的小量（如1ml）放到-20℃凍存，2年穩定。

【注意】：①不要對混濁的溶液進行過濾，因為混濁的溶液意味著未完quan溶解，過濾過程中會造成藥物損失，降低終液的活性。②不建議使用液體培養基，NaCl，磷酸鹽溶液或者有機溶劑來制備儲存液。

1.2   對于G418儲存液（貨號：MS0010-20ML）

本品是基于G418活性濃度配制的無菌溶液，活性濃度為50mg/mL，收到貨di一次使用，可將本品按照更小規格分裝，-20℃保存，以延長本品的保存周期。若使用頻繁，可將本品置于2-8℃保存，至少1年穩定。

二、  常用篩選濃度

一般來說，剛開始篩選轉化子需要高濃度的G418，并用一個較低濃度的G418用于維持培養。生長條件，細胞類型和其他的環境因素都可能影響G418的用量，因此di一次使用的實驗體系建議通過殺滅曲線（kill curve），即劑量反應性曲線，來確定zuijia篩選濃度。

通常情況，哺乳動物細胞篩選范圍200-2000 μg/mL；植物細胞：10-100 μg/mL；酵母細胞：500-1000 μg/mL；網柄菌屬：10-100μg/mL；

以下是一些細胞類型使用G418篩選使用的濃度，可做參考。

三、  殺滅曲線的建立

為了篩選得到穩定表達目的蛋白的細胞株，需要確定能夠殺死未轉染宿主細胞的抗生素zui低濃度，可通過建立殺滅曲線（劑量反應曲線）來實現，至少選擇6個濃度。處理分裂期的細胞時G418的活性zui強，因此在添加G418之前需要讓細胞培養一段時間。

3.1 di一天：未轉化的細胞按照20-25%的細胞密度鋪在合適的培養板上，37℃，CO2培養過夜；【注意】：對于需要更高密度來檢測活力的細胞，可增加接種量。

3.2 根據細胞類型，設定合適范圍內的濃度梯度。以哺乳動物細胞為例，可設定0，50，100，200，400，800，1000 μg/mL。

3.3 第二天：去除舊的培養基，換用新鮮配制的含有相應濃度藥物的培養基。每個濃度做三個平行孔。

3.4 接下來每3-4天更換新的含藥物培養基。

3.5 按照固定的周期（如每2天）進行活細胞計數來確定阻止未轉染細胞生長的恰當濃度。選擇在理想的天數（通常是7-10天）內能夠殺死絕大多數細胞的zui低濃度為穩定轉染細胞篩選用的工作濃度。

四、  穩定轉染細胞的篩選

4.1    轉染48h后，用含有適當濃度的G418篩選培養基來傳代細胞（直接傳代或者稀釋后傳代）。【注意】：

細胞處于活躍分裂狀態時抗生素的殺傷效果最hao。當細胞過于稠密，其效率會降低。為了得到較好的篩選效果，zuihao將細胞稀釋至豐度不超過25%。

4.2    每隔3-4天更換含有藥物的篩選培養基。

4.3    篩選7天后觀察并評估細胞克隆（集落）的形成情況。集落的形成可能還需要一周或者更多的時間，

這取決于宿主細胞類型，轉染，以及篩選效果。

4.4    挑取并轉移5-10個抗性克隆于35mm細胞培養板，繼續用含藥物的篩選培養液維持培養7天。

4.5    之后更換正常培養基培養即可。

注意事項

1）   不要將G418和其他抗生素/抗真菌劑（如青霉su/鏈霉su）共同使用，因為這些抗生素是G418的競爭性抑制劑。其他抗生素也有可能產生交叉反應。

2）   本品以粉末形式提供，非無菌的。因此，配制的溶液需經0.2µm濾膜過濾除菌后再使用。不可高壓滅菌。G418儲存液置于-20℃可穩定保存高達24個月，或置于2-8℃穩定保存高達6個月。

3）   配制G418溶液，一定要根據G418實際批次的活性（potency）來進行換算，從而得到需要活性濃度的儲存液以及工作液。

4）   G418溶于水是呈酸性的，直接加入培養基通常會導致瞬間的pH變化，在含酚紅的培養基內會看容易看到顏色變化。如果培養基本身具有良好的緩沖性，經幾分鐘至數小時pH會回復到正常。如果pH變化是很看重的一個因素，可選擇用緩沖液溶液比如100mM HEPES來配制G418儲存液。

5）   G418加入培養體系中未轉染的細胞有可能不會被殺死，原因在于藥物濃度過低，或者細胞密度過高。另外，快速分裂的細胞相對于緩慢增殖細胞，更容易被殺死。對照細胞（未轉染）可能抗生素添加5-7天后才能殺死，轉染細胞（抗性克隆子）的克隆需要10-14天形成。

6）   即使加入殺死劑量的G418，細胞可能會繼續分裂2-3次。G418的藥效通常在2天后才變得明顯。

7）   為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

常用篩選抗生素及其使用濃度

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 — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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