PKH67細(xì)胞連接試劑盒（用于常規(guī)細(xì)胞膜標(biāo)記）

產(chǎn)品關(guān)鍵詞：

PKH67；PKH26；Calcein AM鈣黃綠素；PKH67；CFDA SE；In vivo cell tracking體內(nèi)細(xì)胞示蹤；Sigma MINI26；Phanos Technologies；

產(chǎn)品信息

【好消息】：應(yīng)客戶的要求，我司對試劑盒內(nèi)的Diluent C可單獨(dú)供應(yīng)，產(chǎn)品信息如下：

產(chǎn)品描述

PKH67細(xì)胞連接試劑盒（用于常規(guī)細(xì)胞膜標(biāo)記）（PKH67 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling）是一款基于熒光探針PKH67，用于常規(guī)細(xì)胞膜標(biāo)記的檢測試劑盒，適用于體外細(xì)胞標(biāo)記，體外細(xì)胞增殖以及長期的體內(nèi)細(xì)胞跟蹤研究等。

PKH67是一種專li的膜標(biāo)記探針，與PKH1和PKH2相比，結(jié)構(gòu)上帶有更長的脂肪族碳尾，能穩(wěn)定插入細(xì)胞膜脂質(zhì)區(qū)域。正因具更長碳尾，內(nèi)部數(shù)據(jù)連續(xù)性證明：PKH67具有比PKH2更低的細(xì)胞-細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)生。PKH67呈綠色熒光（見圖1），最大激發(fā)波長為490nm，最大發(fā)射波長是502nm，與標(biāo)準(zhǔn)熒光素（Fluorescein）濾片兼容。PKH67非常適合用于細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，與碘化丙啶（PI，MX4205）或7-氨基放線jun素D（7-AAD，MX4215）這些細(xì)胞活力探針聯(lián)合使用，或者與橙-紅色熒光探針比如藻紅蛋白（PE，MX4698）、紅色熒光蛋白（RFP）等結(jié)合使用。根據(jù)染料稀釋原理，PKH67常用于細(xì)胞增殖監(jiān)測分析，包括抗原特異性的前體頻率和帶干細(xì)胞特性的靜息/緩慢分化腫瘤細(xì)胞的鑒定。也能用于監(jiān)測外泌體或脂質(zhì)體吞噬，細(xì)胞-細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)、吞噬、抗原遞呈，以及體內(nèi)細(xì)胞運(yùn)輸研究。

以不分裂細(xì)胞為研究對象，通過對體外細(xì)胞膜滯留周期和體內(nèi)熒光強(qiáng)度減弱頻率的關(guān)聯(lián)性分析，預(yù)測PKH67的體內(nèi)熒光半衰期為10-12天。這與PKH1和PKH2的體內(nèi)半衰期相近，這兩個(gè)探針都成功用于監(jiān)測周期長達(dá)1-2個(gè)月的體內(nèi)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞運(yùn)輸研究，因此，PKH67適用于需要綠色熒光細(xì)胞連接染料的短-中期體內(nèi)示蹤研究，以及體外細(xì)胞毒性、吞噬、增殖、抗原遞呈，或其它共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

稀釋液C（Diluent C）是本試劑盒配套提供的一種水溶性溶液，特別設(shè)計(jì)的一種標(biāo)記媒介能維持細(xì)胞活力，同時(shí)zui大化染料溶解性和標(biāo)記過程中的染色效率。Diluent C對哺乳動(dòng)物細(xì)胞來說是等滲的，不含去污劑或有機(jī)溶劑，也不含生理鹽和緩沖劑。根據(jù)細(xì)胞類型，染料標(biāo)記后膜的內(nèi)在化程度，標(biāo)記細(xì)胞可能呈現(xiàn)不同的狀態(tài)，從明亮，到均勻點(diǎn)狀或斑駁狀。然而，PKH67熒光在生理范圍內(nèi)不依賴于pH，且每個(gè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度通常不受染料位置的影響。

圖1. PKH67的激發(fā)和發(fā)射光譜圖

我司（懋康生物）提供三種規(guī)格的PKH67細(xì)胞連接試劑盒（用于常規(guī)細(xì)胞膜標(biāo)記），其中：

Mini Kit（CAT#：MX4023-100UL）建議用于小量或初步研究。當(dāng)使用2ml染色體積（含2μM終濃度的PKH67），本試劑盒含有足量的染料用于檢測25次細(xì)胞樣本（2×107個(gè)細(xì)胞/次），和足量的Diluent C用于5次細(xì)胞樣本（2×107個(gè)細(xì)胞/次）。用戶需根據(jù)細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩韮?yōu)化確定的染料濃度。

Midi Kit（CAT#：MX4023-200UL）適用于中量研究，比如體外細(xì)胞增殖或毒性研究。當(dāng)使用2ml染色體積（含2μM終濃度的PKH67），本試劑盒含有足量的染料用于檢測50次細(xì)胞樣本（2×107個(gè)細(xì)胞/次），和足量的Diluent C用于30次細(xì)胞樣本（2×107個(gè)細(xì)胞/次）。用戶需根據(jù)細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩韮?yōu)化確定的染料濃度。

Maxi Kit（CAT#：MX4021-500UL）適用于大量或體內(nèi)研究。當(dāng)使用2ml染色體積（含2μM終濃度的PKH67），本試劑盒含有足量的染料用于檢測125次細(xì)胞樣本（2×107個(gè)細(xì)胞/次），和足量的Diluent C用于30次細(xì)胞樣本（2×107個(gè)細(xì)胞/次）。用戶需根據(jù)細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩韮?yōu)化確定的染料濃度。

產(chǎn)品包裝

保存與運(yùn)輸方法

保存：2-8oC避光保存，1年有效。其中組分A（PKH67 Dye）需嚴(yán)格避光，蓋子保持?jǐn)Q緊。

運(yùn)輸：冰袋運(yùn)輸。

注意事項(xiàng)

1. PKH67是以溶于乙醇的儲(chǔ)存液形式提供，保存的過程中需避光并擰緊蓋子，以防止溶液揮發(fā)引起的染料濃度提高。使用前需檢查是否有結(jié)晶，若有結(jié)晶，需在37℃水浴溶晶，超聲或渦旋直至完quan溶解。

2. Diluent C使用前需置于室溫回溫之后再配制標(biāo)記用的細(xì)胞和染料工作液。Diluent C是無菌溶液，不含任何防腐劑或抗生素，使用和保存過程中都注意無菌。

3. PKH67不能保存在Diluent C內(nèi)，保存在Diluent C的染色工作液需在使用前配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。

4. 熒光染料均存在淬滅問題，操作和儲(chǔ)存過程中需注意避光，以減緩熒光淬滅。

5. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

操作步驟

1. 自行準(zhǔn)備儀器和試劑（試劑盒不提供，用于常規(guī)細(xì)胞膜標(biāo)記）

﹒良好分散，均勻的單細(xì)胞懸液（懸浮于組織培養(yǎng)基）

﹒含血清的組織培養(yǎng)基（完quan培養(yǎng)基）

﹒不含Ca2+、Mg2+和血清的培養(yǎng)基，或生理鹽溶液（比如，DPBS或HBSS）

﹒血清，白蛋白或其他系統(tǒng)兼容的蛋白

﹒聚丙烯錐底離心管（4-15ml）

﹒能控溫的離心機(jī)（高達(dá)1000×g）

﹒熒光分析用儀器（熒光酶標(biāo)板，熒光或共聚焦顯微鏡，流式細(xì)胞儀）

﹒無菌層流凈化罩

﹒血球計(jì)數(shù)板或自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)裝置

﹒載玻片和蓋玻片

2. 常規(guī)細(xì)胞膜標(biāo)記

【染色流程】：

以下操作流程使用2ml最終染色體積，含2μM PKH67，以及1×107個(gè)細(xì)胞/ml。

以下所有步驟都在室溫下進(jìn)行（20-25℃）。

1. 取一錐底聚丙烯離心管制備2×107個(gè)細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液，用無血清培養(yǎng)基清洗細(xì)胞一次。

2. 400×g離心細(xì)胞5min，得到松散的細(xì)胞沉淀。

3. 細(xì)胞離心后，輕輕吸掉上清。注意不要移動(dòng)任何細(xì)胞并且殘留不超過25μl上清液。

4. 加1ml Diluent C到細(xì)胞沉淀中制備成2×細(xì)胞懸液，用槍輕輕吹勻以確保完quan分散。不可渦旋和不可讓細(xì)胞長期保留在Diluent C中。

5 染色前立即制備2×染色液（4μM in Diluent C）：通過將4μl PKH67乙醇儲(chǔ)存液到1ml Diluent C中，充分混勻分散所得。

6. 快速加1ml2×細(xì)胞懸液（Step 1.4）到1ml2×染色液（Step 1.5），用槍立即混勻樣本。混勻后樣本得到的終濃度是1×107個(gè)細(xì)胞/ml和2μM PKH67。

7. Step 1.6中的細(xì)胞/染料懸液孵育1-5min，中間定期混合。染色過程非常快，更長時(shí)間無任何益處。

8. 加入等體積（2ml）血清或其他適當(dāng)?shù)鞍兹芤海ū热?% BSA）終止染色，孵育1min允許結(jié)合多余的探針。

9. 20-25℃，400×g離心細(xì)胞10min，輕輕吸掉上清，確保不會(huì)移動(dòng)細(xì)胞。用10ml完quan培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈無菌的錐底聚丙烯離心管中，20-25℃，400×g離心細(xì)胞5min。然后用10ml完quan培養(yǎng)基清洗細(xì)胞沉淀＞2次，以確保完quan去除未結(jié)合染料。

10. 最后一步清洗后，用10ml完quan培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，用來評估細(xì)胞回收，細(xì)胞活力和染色強(qiáng)度。離心和重懸沉淀到一理想終濃度的活細(xì)胞懸液。

染色示例（來自文獻(xiàn)資源）

1）文獻(xiàn)來源：Kelly DM, ten Bokum AM, O'Leary SM, O'Sullivan MP, Keane J. Bystander macrophage apoptosis after Mycobacterium tuberculosis H37Ra infection. Infect Immun. 2008;76(1):351-360. doi:10.1128/IAI.00614-07

PKH67染色目的（MKBIO）：為了評估旁觀者凋亡效應(yīng)，靶向THP-1單核細(xì)胞用PKH67來標(biāo)記，最終在熒光顯微鏡觀察以確認(rèn)標(biāo)記是否成功。標(biāo)記好的THP-1細(xì)胞（未感染的旁觀者細(xì)胞量：0.5 × 105cells/ml），加入被H37Ra感染的THP-1巨噬細(xì)胞（感染效應(yīng)細(xì)胞量：0.5 × 105cells/ml），接種到2孔的LabTek腔室玻片。效應(yīng)巨噬細(xì)胞經(jīng)H37Ra感染4h，之后劇烈清洗去除胞外細(xì)菌。之后與未感染的PKH67標(biāo)記旁觀者細(xì)胞共培養(yǎng)，37℃共培養(yǎng)24或48h。孵育后，上清液去除，細(xì)胞用2% PFA固定，然后用TUNEL TMR監(jiān)測凋亡，細(xì)胞核用Hochest 33342復(fù)染。用熒光顯微鏡來評估綠色PKH67標(biāo)記巨噬細(xì)胞的旁觀凋亡效應(yīng)。當(dāng)某一個(gè)單細(xì)胞同時(shí)呈綠色（旁觀者）和紅色（凋亡），表明旁觀者凋亡效應(yīng)的存在。

Fig 2. Uninfected bystander apoptosis for macrophages that were in contact with infected macrophages. (A) Macrophages were infected for 4 h with M. tuberculosis strain H37Ra. Uninfected PKH67-labeled green THP-1 cells (0.5 × 105 cells/ml) were added to infected macrophages for 24 and 48 h. Adherent cells were then stained with Hoechst 33342 and with TUNEL TMR (red) to determine apoptosis levels. Superimposition of PKH67-labeled (green) bystander cell fields and TUNEL-positive (red) fields showed bystander apoptotic macrophages (orange). Nuclear staining (blue) (not shown) revealed the total number of cells per field. One representative field at a magnification of ×20 is shown. The arrows indicate apoptotic bystander macrophages. (B) Close-up of apoptotic bystander macrophage (arrow).

2）文獻(xiàn)來源：Hellberg L, Fuchs S, Gericke C, et al. Proinflammatory stimuli enhance phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes. ScientificWorldJournal. 2011;11:2230-2236. doi:10.1100/2011/413271

PKH67染色目的（MKBIO）：50ul肝素化全血用TLR-ligands和細(xì)胞因子刺激30min，之后，將1 × 106PKH67標(biāo)記好的凋亡自體中性粒細(xì)胞加入全血中，置于37℃孵育。60min之后，紅細(xì)胞用裂解液裂解掉，流式細(xì)胞術(shù)觀察中性粒細(xì)胞內(nèi)凋亡細(xì)胞的吞噬水平。

Fig 3. Phagocytosis of apoptotic neutrophils by neutrophils in whole blood. 50?μL heparinized whole blood was preincubated with the indicated stimuli for 30?min and, subsequently, 1 × 106 PKH67 stained apoptotic neutrophils were added. Phagocytosis was assessed after 60?min by using flow cytometry. (a) Effect of TLR-ligands on the phagocytosis rate. (b) Effect of various cytokines on the phagocytosis rate. Data show mean + SD from 3 independent experiments, *:P < 0.05. (c)–(f) Representative dot-plots for the quantitative assessment of ingestion of apoptotic cells by neutrophils in whole blood by using flow cytometry. (c) FSC/SSC gating of neutrophils. (d) Negative control: gated neutrophils without apoptotic cells. (e) neutrophil phagocytosis of PKH67-labeled (green) apoptotic neutrophils. (f) Neutrophil phagocytosis of PKH67-labeled (green) apoptotic neutrophils after exposure to Pam3CSK4.

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— —Written/Edited by V. Shallan【版權(quán)歸MKBio懋康所有】

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